檢測水中滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的具體方法

  在一些微生物實(shí)驗(yàn)室或者需要無菌操作的場所，想了解滅菌的具體效果就需要生物指示物的幫助。通常滅菌指的是用物理或化學(xué)的方式將目標(biāo)微生物全部殺滅，使之達(dá)到無菌保障水平，一般最常用的有化學(xué)試劑、射線、濕熱、干熱以及過濾等除菌手段。針對不同的微生物采用的方法也不一樣。而想要驗(yàn)證這些方法的效果，就需要一些具有滅菌耐受力的活微生物作為指示物來進(jìn)行判斷。

  今天我們要講的枯草芽孢桿菌黑色變種主要用于各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)及制藥工業(yè)領(lǐng)域的消毒效果驗(yàn)證中，其原理是經(jīng)過滅菌處置后含有枯草芽孢桿菌黑色變種的水樣在通過孔徑為0.45um的濾膜后，細(xì)菌和芽孢被截留在濾膜上，然后將濾膜置于酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上，36℃±1℃培養(yǎng)72h-96h，枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，產(chǎn)生黑色的特征菌落。對特征菌落進(jìn)行染色鏡檢后通過生化試驗(yàn)做進(jìn)一步鑒定，能利用甘油和甘露糖，可還原硝酸鹽和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷和甘露醇，并確認(rèn)為革蘭氏陽性芽孢桿菌的特征菌落為枯草芽孢桿菌黑色變種，鑒定結(jié)果為陽性。

檢測所用試劑

1.酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基。

2.營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

3.淀粉培養(yǎng)基和碘液。

4.硝酸鹽還原培養(yǎng)基和相關(guān)試劑。

5.甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基。

6.甘露糖生化培養(yǎng)基。

7.甘露醇生化培養(yǎng)基。

8.苦杏仁苷生化培養(yǎng)基。

9.革蘭氏染色液。

10.芽孢染色液。

11.陰性對照菌：如地衣芽孢桿菌。

12.陽性對照菌：枯草芽孢桿菌黑色變種。

13.枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液

按照《消毒技術(shù)規(guī)范》的規(guī)定制備，也可購買濃度范圍在106CFU/ml-109CFU/ml之間的市售枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液。

14.無菌濾膜：直徑50mm，孔徑0.45μm的醋酸纖維濾膜。

按無菌操作要求包扎，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，晾干備用；或?qū)V膜放入燒杯中，加入實(shí)驗(yàn)用水，煮沸滅菌3次，15min/次，前2次煮沸后需換水洗滌2-3次。也可采用市售的無菌濾膜。

15.石蠟質(zhì)封口膜。

16.無菌水：取適量實(shí)驗(yàn)級純水，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

檢測所需試劑

1.樣品瓶：螺口帶蓋或磨口具塞的250ml、500ml廣口玻璃瓶。

2.恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。

3.高壓蒸汽滅菌器：121℃，可調(diào)。

4.pH計(jì)：準(zhǔn)確到0.1pH單位或更高精度。也可使用pH精密試紙。

5.顯微鏡：物鏡4×或5×、10×、20×、40×，油鏡100×，目鏡10×或15×。

6.分析天平：實(shí)際分度值0.0001g。

7.培養(yǎng)皿：直徑90mm。

8.過濾裝置：配有砂芯濾器、圓筒形玻璃漏斗和真空泵，抽濾壓力不低于-50kPa。

9.接種環(huán)：直徑1mm-3mm。

10.鑷子：不銹鋼或一次性無菌塑料鑷子。

11.刻度移液管：1ml、10ml。也可使用可調(diào)式移液器。

12.量筒：100ml。

13.錐形瓶：100ml。

14.酒精燈。

15.試管：10ml。

16.無菌操作設(shè)備：無菌室、超凈工作臺、生物安全柜。

17.一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

水樣采集

  評價使用高溫高壓滅菌設(shè)備的滅菌效果時，取樣品瓶，加入枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液及200ml無菌水使混合液中枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢終濃度達(dá)到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。滅菌處置完畢后，取出樣品瓶，對水樣進(jìn)行滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的檢測。

  評價使用其它滅菌設(shè)備的滅菌效果時，滅菌前取適量枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液加入滅菌設(shè)備，使水樣中枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢終濃度達(dá)到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。滅菌處置完畢后，從滅菌設(shè)備中采集水樣，進(jìn)行滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的檢測。采樣量一般為樣品瓶容量的80%左右，不得用樣品洗滌樣品瓶。樣品采集完畢后，迅速用無菌包裝紙包扎樣品瓶。

  樣品采集后宜在2h內(nèi)檢測，否則應(yīng)在10℃以下冷藏保存運(yùn)輸，但不得超過6h。實(shí)驗(yàn)室接收樣品后，不能立即開展檢測的，樣品應(yīng)在4℃以下冷藏保存，并在2h內(nèi)檢測。

水樣過濾

  用無菌鑷子以無菌操作夾取無菌濾膜貼放在已滅菌的過濾裝置上，固定好過濾裝置。將樣品充分混勻后取100 ml 抽濾，以無菌水沖洗濾器內(nèi)壁2-3 次。樣品過濾完成后，再抽氣約5s，關(guān)上開關(guān)。過濾前按照無菌操作要求調(diào)節(jié)樣品的pH值至7.0-8.0。

培養(yǎng)流程

  用滅菌鑷子夾取濾膜移放在酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后用石蠟質(zhì)封口膜封好培養(yǎng)皿，倒置培養(yǎng)皿，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)72h-96h。

  培養(yǎng)96h后，如培養(yǎng)基上未有菌落生長，則試驗(yàn)終止；如培養(yǎng)基上有菌落生長，則挑取黑色的特征菌落于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，36℃±1℃培養(yǎng)24h，待鑒定。同時將已挑菌落的酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿儲存于2℃-5℃，以備必要時復(fù)查。

染色鏡檢

  挑取黑色或可疑菌落，分別使用革蘭氏染色液和芽孢染色液染色，枯草芽孢桿菌黑色變種革蘭氏染色鏡檢以及芽孢染色鏡檢可以參考相關(guān)鏡檢圖，枯草芽孢桿菌黑色變種為革蘭氏陽性菌，營養(yǎng)細(xì)胞呈桿狀，單個或呈短鏈狀排列。

生化實(shí)驗(yàn)

  挑取黑色或可疑菌落，分別接種到淀粉培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基、甘露糖生化培養(yǎng)基、甘露醇生化培養(yǎng)基和苦杏仁苷生化培養(yǎng)基上。

空白對照實(shí)驗(yàn)

  用無菌水按照過濾和培養(yǎng)步驟進(jìn)行操作；培養(yǎng)96h后平板培養(yǎng)基上應(yīng)無菌落生長，否則，該次樣品鑒定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新采樣和檢測。

陰性及陽性對照

  將陰性對照菌和陽性對照菌制成濃度為40CFU/L-600CFU/L的菌懸液，分別按照過濾、培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)的步驟操作。陰性、陽性對照菌呈現(xiàn)的生化反應(yīng)結(jié)果應(yīng)與參照表所列結(jié)果一致，否則該次水樣鑒定結(jié)果無效，此時查明原因后重新采樣和檢測。

結(jié)果判斷

  100ml水樣中檢出枯草芽孢桿菌黑色變種，即可斷定滅菌不合格；而如果在100mL水樣中未檢出枯草芽孢桿菌黑色變種，可評價為滅菌合格。

  水質(zhì)檢測